精准前沿丨空间转录组结合单细胞转录组解析结直肠癌侵袭前沿的免疫微环境

本期《精准前沿》栏目分享日本九州大学等科研单位的研究人员及其合作者们发表于Cell Reports（IF=9.995）的一篇研究[1]，研究利用空间转录组测序技术对结直肠癌患者的肿瘤组织进行检测，结合公共数据库中的结直肠癌肿瘤组织的单细胞测序数据进行分析，发现了结直肠癌肿瘤侵袭前沿的免疫微环境中存在一些特别的细胞互作类群，具体体现在HLA-G+癌细胞和SPP1+巨噬细胞在TME中发挥的作用及它们之间的交流。此外，研究者也在小鼠皮下瘤模型中，通过敲除cancer cell中的HLA-G同源基因，进一步验证了HLA-G+癌细胞可以诱导SPP1+巨噬细胞，进而抑制微环境中的抗肿瘤免疫作用这一假设。 

研究背景

结肠癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率在全球范围内均居高不下。肿瘤免疫逃逸和肿瘤微环境（TME）的形成是结肠癌发生和发展的重要因素。再者近些年的免疫治疗药物例如pembrolizumab和nivolumab——程序性死亡1（PD-1）抑制剂在结直肠癌（CRC）的治疗上表现出一定的潜力，但大多数CRC患者未从治疗中受益，这表明需要更详细地了解肿瘤微环境（TME）中的免疫抑制机制。目前，在CRC研究中，其TME哪些细胞相互接近，它们如何相互作用以及TME如何影响它们的相互作用仍不清楚。最近空间转录组学的进展使得可以同时确定TME中数十种不同的细胞的位置，这对于理解肿瘤细胞与非肿瘤细胞的相互作用至关重要。因此，将单细胞转录组数据与高维空间转录组数据相结合，将有助于理解TME中的细胞间通讯。

以往研究认为HLA-G和SPP1在结肠癌中的表达与肿瘤免疫逃逸和肿瘤微环境的形成有关。在巨噬细胞中，SPP1的表达被认为与M2型巨噬细胞的表型相关，因此SPP1+巨噬细胞可能会在抑制肿瘤免疫以及促进肿瘤生长过程中发挥作用。然而，这些细胞相关的免疫微环境中的细胞互作仍不清楚。  

研究设计

本研究分析了1例结肠癌患者位于升结肠的肿瘤组织，对此处组织进行了切片做空间转录组测序（10X Genomics），同时结合来自三星医学中心的公共数据库中，23位结直肠癌患者的肿瘤单细胞测序数据，对空间转录组数据进行细胞类型分析、细胞空间互作定位和相关分子空间表达定位等。

研究设计流程图

研究结果

1. 单细胞数据的聚类分析及细胞类群注释

首先对来自韩国三星医学中心（SMC）的23名亚洲CRC患者的公共单细胞转录组数据进行分析。进行质控后65,362个细胞被纳入后续分析，这些细胞被分为六类：上皮细胞、T细胞、B细胞、髓系细胞、基质细胞和肥大细胞（图1. A）。其中上皮细胞又被进一步分类为14类，以0-13编号命名（图1. B）。与此同时，也对无监督聚类的多个细胞cluster进行了细胞亚群的定义，其中包括各类T细胞亚群、B细胞亚群等的细分（图1. C）。

图1. 单细胞数据聚类及注释

2. 上皮细胞各亚群的marker

接下来研究聚焦到上皮细胞中，鉴定了上述0-13上皮细胞各亚群的的标记基因，但是12、13两个上皮细胞亚群没能发现代表性marker（图2），表格展示了0-11上皮细胞亚群的marker。

图2. 上皮细胞亚群0-11的marker及其表达水平

表1. 上皮细胞亚群0-11的marker列表  

3. 推测各上皮细胞亚群在空间转录组上的位置

如取材示意图中所示，肿瘤侵袭前沿位于肿瘤核心区和正常上皮组织之间（蓝色区域）。通过使用生信计算工具Cell2location估计了上皮细胞的空间分布。结果显示，上皮细胞2、4、6、9、11、12和13在正常结肠组织区域丰富，而上皮细胞0、1、3、5、7、8和10在CRC组织区域中丰富。其中，上皮细胞0、1、3、8和10集中在肿瘤核心区域，而5和7集中在侵袭前沿（图3）。

图3. 解析各类上皮细胞在空间转录组中的定位

4. 定位于肿瘤侵袭前沿的上皮细胞亚群的一些转录组特征

对定位于侵袭前沿的上皮细胞5和7进行GO富集，发现与增殖（表皮生长因子受体通路）和免疫（抗原处理和呈递、干扰素信号和先天免疫系统通路）相关的通路在侵袭前沿富集（图4. C）。这表明，在侵袭前沿，CRC细胞可能受到各类细胞（巨噬细胞、T细胞、B细胞和成纤维细胞）的影响更大。此外，还分析了上皮细胞亚群的分化程度stemness和增殖能力proliferation，并显示上皮5比上皮7分化程度低，增殖能力更高（图4. D）。

图4. 上皮细胞5和7的转录组特征分析（GO富集）及各上皮细胞类群干细胞特性、增殖特性分析  

5. SPP1+巨噬细胞与上皮细胞亚群5和7共定位于侵袭前沿

进一步的分析则是探究与上皮细胞5和7在侵袭前沿共定位的细胞类型，以及与肿瘤中心区的CRC细胞（上皮细胞0和1）共定位的细胞类型，方法是基于Cell2location估计的空间分布（图5）。从结果中可以看出，在侵袭前沿，上皮细胞5和7与SPP1+巨噬细胞的共定位频率比其他细胞高，而SPP1+巨噬细胞可能在抑制肿瘤免疫和促进肿瘤进展方面发挥核心作用。

图5. 基于Cell2location估计各类细胞在侵袭前沿与上皮细胞亚群0、1、5、7共定位的情况  

6. SPP1+巨噬细胞通过表达趋化因子募集相应免疫细胞

为了探究TME中淋巴细胞的募集情况，接下来分析了单细胞数据中，诱导淋巴细胞的趋化因子和细胞因子的表达（图6. B）以及相应的受体的表达（图6. C）。结果中可以看出，趋化因子（C-X-C基序）配体16（CXCL16）与C-X-C趋化因子受体6（CXCR6）结合。CXCL16在SPP1+巨噬细胞和上皮细胞5中高表达，CXCR6是T辅助细胞（Th17）、调节性T细胞（Treg）和簇分化（CD）8+ T细胞表达的受体，可招募这些细胞到相应组织中。CXCL9与CXCR3结合。CXCL9在SPP1+巨噬细胞中也高表达，CXCR3是CD8+ T细胞和Treg细胞表达的受体，SPP1+巨噬细胞也可通过CXCL9-CXCR3招募CD8+ T细胞和Treg到侵袭前沿中。同时，空间转录组上分子表达定位的结果也显示，这些分子（CXCL9、CXCL16）和细胞（SPP1+巨噬细胞、CD8+ T细胞和Treg细胞）在侵袭前沿高表达（图6. D）。多重免疫荧光染色显示，巨噬细胞分布在整个肿瘤中；然而，SPP1+巨噬细胞仅存在于侵袭前沿（图6. E）。

图6. 趋化因子受体配体在各细胞亚群的表达情况和空间定位情况

为了分析TME中淋巴细胞耗竭的情况和机制，我们分析了淋巴细胞耗竭标记物和各种耗竭标记物的细胞配体的表达（图7. F、G）。大多数配体由髓系细胞分泌，包括SPP1+巨噬细胞。同时，空间转录组的数据在侵袭前沿区域确认了耗竭标记物（PDCD1、CTLA4、HAVCR2、LAG3和T TIGIT）及其配体（LGALS9和CD80）的高表达（图7. H）。这表明SPP1+巨噬细胞可能在侵袭前沿耗竭其他免疫细胞。

图7. 细胞耗竭相关基因在各细胞亚群的表达情况和空间定位情况

7. HLA-G在侵袭前沿的癌细胞与SPP1+巨噬细胞的互作中发挥作用

为了解是何种分子机制使得肿瘤侵袭前沿出现SPP1+巨噬细胞，研究使用了分析工具NicheNet确定了影响SPP1+巨噬细胞活性的前20个配体（图8），并将这些配体按重要性从高到低排序，从左侧（HLA-G）到右侧（GAST），并且该气泡图展示了这20个配体在单细胞数据各细胞类群的表达情况。HLA-G在各种癌症的肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）/单核细胞中表达。在本研究中，HLA-G主要表达在上皮细胞群5中，该细胞群与SPP1+巨噬细胞相邻。当巨噬细胞与HLA-G结合时，会分泌IL-10和转化生长因子(TGF)-b1获得免疫抑制性表型。此外，HLA-G促进M2巨噬细胞极化。然而，TAMs和其HLA配体的抑制性受体之间的相互作用及其对免疫抑制功能的影响仍不清楚。但这里推测SPP1+巨噬细胞可能是肿瘤细胞在浸润前沿产生的，诱导产生额外的SPP1+巨噬细胞并抑制免疫功能。

图8. 基于NicheNet估计对SPP1+巨噬细胞影响最大的20个基因的表达情况  

接下来研究者同样使用NicheNet对上皮细胞5的重要影响因素进行分析，并展示TOP20配体基因的表达情况（图9），结果证明了由SPP1+巨噬细胞分泌的几种配体介导了对上皮细胞5的主要信号。例如，我们观察到CCL2与侵袭能力有关，基质金属单细胞酶9（MM9）与侵袭和增殖能力有关等（图9）。这些细胞因子和趋化因子在SPP1+巨噬细胞中存在表达，它们增加了结肠癌细胞在进展性浸润区的增殖和侵袭的可能性。

图9. 基于NicheNet估计对上皮细胞亚群5影响最大的20个基因的表达情况

此外，研究者也在空间转录组数据上分析 了HLA-G、IL-1B，IL-10，MMP9等基因的空间分布（图10）。虽然这些基因多数总表达水平相对较低，但它们的表达都倾向定位于浸润前沿。

图10. NicheNet预估的有代表性的基因在空间转录组中的定位情况

8. SPP1+巨噬细胞与HLA-G癌细胞共定位于CRC侵袭前沿的芽区

研究使用IHC对上述论点进行了进一步的验证，在CRC肿瘤组织上进行了SPP1和HLA-G的免疫染色，发现在SPP1阴性的组织切片区域，其HLA-G的着色也是阴性的，反之则存在HLA-G的阳性着色，并且在统计上也有显著性（图11. A、B）。此外，研究还在CRC组织中进行CD68（巨噬细胞的marker）和SPP1的免疫染色，发现在肿瘤侵袭前沿区域，CD68标记的巨噬细胞广泛存在，但SPP1+免疫细胞只存在于侵袭前沿的芽区（budding area），且在统计中，肿瘤中心区域和侵袭前沿的非芽区，SPP1+巨噬细胞占CD68+总巨噬细胞的比例较低，而在侵袭前沿的芽区，这一比例则显著升高（图11. C、D）。

图11. IHC展示SPP1+巨噬细胞、HLA-G+癌细胞、CRC的萌芽区的相关性    

9. 小鼠皮下瘤模型验证HLA-G缺失可减少TME中的SPP1+巨噬细胞，进而减弱肿瘤生长

研究者也进行了小鼠皮下瘤模型的验证，在小鼠结肠癌细胞系MC38中敲除HLA-G的同源基因H2-M3，用于造模（图12. A）。发现敲除这一HLA-G同源基因后，肿瘤的生长受到限制，体积显著低于对照组sgCTR（图12. B、C）。进一步对小鼠的皮下瘤组织进行免疫荧光染色，发现对照组的组织切片存在SPP1和CD68双阳性区域，但敲除组则只存在CD68着色，统计结果也显示敲除组的免疫荧光视野中SPP1+巨噬细胞显著偏低（图12. D、E）。这说明敲除HLA-G同源基因的肿瘤细胞，不能够共定位到SPP1+巨噬细胞，肿瘤微环境中则不易出现免疫抑制的作用，因此，肿瘤进展则会受到抑制，进而减小肿瘤的体积。

图12. 小鼠皮下瘤模型说明敲除HLA-G同源基因抑制肿瘤生长和SPP1+巨噬细胞在其中的浸润

讨论

本文探究的问题是免疫微环境中肿瘤细胞与巨噬细胞的相互作用。巨噬细胞在肿瘤微环境中的作用是复杂的，并且可能在肿瘤的发展和进展中发挥着不同的作用。例如，一些研究表明，巨噬细胞可以促进肿瘤的生长和侵袭，而另一些研究则表明，巨噬细胞可以抑制肿瘤的生长和侵袭。该研究的结果表明，SPP1+巨噬细胞可能在结直肠癌的发展和进展中发挥着促进作用。此外，本研究在空间转录组的研究方法上提供了新思路，但纳入的空间转录组样本虽有多张切片，但均来自于同一个患者的一个肿瘤组织，在侵袭前沿的免疫微环境的部分探究结论未来仍需更多的空间转录组样本来验证。

结语

综上所述，本研究利用空间转录组学和单细胞转录组测序技术，揭示了结肠癌浸润前沿的免疫微环境中，存在HLA-G+癌细胞和SPP1+巨噬细胞的共定位，并且发现肿瘤细胞可能通过表达HLA-G增加微环境中SPP1+巨噬细胞数量来抑制肿瘤免疫应答。最后，通过敲除小鼠结肠癌细胞中的HLA-G同源物H2-M3，证明了HLA-G发挥抑制免疫作用对肿瘤生长和浸润的影响。这些发现为结肠癌的治疗和预后提供了新的靶点和策略。

END 

参考文献：   [1]  Ozato Y, Kojima Y, Kobayashi Y, et al. Spatial and single-cell transcriptomics decipher the cellular environment containing HLA-G+ cancer cells and SPP1+ macrophages in colorectal cancer. Cell Rep. 2023;42(1):111929. doi:10.1016/j.celrep.2022.111929